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ImageJ (
https://imagej.nih.gov/ij/)是美国National Institutes of Health (NIH)开发的基于Java的免费公共图像处理软件，在生物及医学图像分析中起着非常重要的作用。
ImageJ可在一个窗口中显示多个空间或时间相关的图像，这些图像集称为图像栈（Stack），组成Stack的图像称为Slice。Stack图像是SCI论文中常用的图像类型：
今天半夏给大家分享Stack图形的概念、基本操作与实际应用。
1 Stack图像介绍
数字图像不仅是二维图片或具有多个通道的二维图片，Stack图片具备有三个空间维度：X，Y和Z。
Hyperstacks具有四个以上维度，例如X（长），Y（宽），Z（片），C（通道）和t（时间帧）。
下图为ImageJ官网示例Stack图片t1-head.tiff，2维图像（XY视图）窗口如左侧窗口（256 x256），当前Slice为129张图片的第58张。t1-head.tiff图片属性如右图所示：
共聚焦图片Z-Stack层扫可以得到Stack或Hyperstacks图片，下图为共聚焦系列图片，该图片包含红、绿两通道以及Z轴25张切片：
图片属性可通过Image -> Properties得到：
2 如何显示Stack图片中的所有切片？
Make Montage可以得到一个单一图片，该图片包含Stack图片中的所有图像，步骤为：
Image -> Stacks -> Make Montage。Make Montage命令窗口可以通过Columns与Rows设置产生图片的布局（下图为7列3行），选择制作Montage切片的范围（First Slice，Last Slice）等：
下图是SCI文章中的Montage图：
反之，Montage图也可以转换成Stack图。方法为：
Image -> Stacks -> Tools -> Montage to Stack。
3
Stack图像Orthogonal Views（正交视图）
正交视图除显示Stack图像的XY视图外，还可显示XZ、YZ投影图像。XZ、YZ投影图像显示在原始图像的旁边：
步骤为Image -> Stacks -> Orthogonal Views。鼠标点击位置为三个视图的交点，交点可在XY、XZ与YZ视图中显示，可以拖动鼠标来控制交点位置：
拓展：正交视图的应用
正交视图在SCI论文中常用来显示三维共定位，下图层扫共聚焦图片通过正交视图可显示BrdU与GAD在三维空间中存在共定位：
正交视图实际上仅能提供来自不同角度的临时数据，如何得到上述SCI论文中显示的图片？
以confocal-series.tif图像为例，步骤如下：
1、 ImageJ软件打开confocal-series.tif，Image -> Color -> Stack to RGB将多通道图片转变为RGB图片，此时confocal-series.tif为RGB图片且包含多张切片：
2、 正交视图：Image -> Stacks -> Orthogonal Views
3、 保存XY、XZ与YZ视图
XZ、YZ视图直接通过File -> Save as tiff：
XY视图保存：
XY视图保存需要将不同切片进行Z方向投影，方法为Image -> Stacks -> Z projection…
Z projection功能支持6种不同的投影方式：
Average Intensity，均值投影，每个图像的像素是Stack图像中所有图像在相应位置像素的均值。
Max/Min Intensity，最大/最小投影，图像中每个像素是Stack图像中相同位置所有图像中的最大/最小值。
Sum Slices，Stack图像的总和。
Standard Deviation，所有切片的标准差。
Median，中值投影输出的图像，图像中每个像素是Stack图像中在相应位置像素的中值。
在此我们选择Max Intensity，得到XY视图：
File -> Save as tiff即可。
4、打开PhotoShop（PS），打开保存好的XY、XZ与YZ视图：
使用直线工具在各视图中画直线：
得到SCI文献中三维共定位正交视图：
拓展：
Z projection可将共聚焦层扫图片进行最大密度投影得到清晰的图像，例如具备突起的细胞。左侧为Stack图片，右侧为经过Z projection最大密度投影的图片，最大密度投影的图片可以完整的显示星形胶质细胞的突起：
4 Stack图像3D投影
3D投影是用来创建一个沿着（X、Y或Z轴）旋转的投影，该投影具有三维效果。
步骤为：Image -> Stacks -> 3D Projection…
File -> Save as Gif可以创建3D效果的动图，SCI论文中可以用这种方法来显示三维动态效果：
5 Stack图像绘制Z轴剖面图
Z轴剖面图可以获得选择ROI（感兴趣区）的平均灰度值，方法为：
Image -> Stacks -> Plot Z-axis Profile…
使用矩形、椭圆、不规则或自由形状工具在confocal-series.tif中绘制ROI：
点击Plot Z-axis Profile 获得结果Live即可得到实时ROI对应的Z轴剖面图：
应用实例：
分析时间序列图像。下图是Elife（IF=7.616）中记录时间依赖的钙成像，横坐标是时间纵坐标是钙信号，反映的是不同时间点钙信号的动态变化：
步骤：
1、 ImageJ打开时间序列Stack图像，Z轴为时间：
2、 添加感兴趣的ROI，Image -> Stacks -> Plot Z-axis Profile…即可得到ROI荧光强度随时间的变化：
点击List得到ROI荧光强度随时间的变化的数值，保存数据可进行重新绘图：
今天给大家分享了ImageJ分析Stack图像的基本操作及其实际应用，希望对大家有所帮助！